手順2：サンプル濃度と分子量の定量的ガイド¶

オプションA：核酸濃度の評価。¶

1. 核酸は260nmでUV光を非常に強く吸収するので、一連の核酸サンプルの濃度希釈シリーズを分光光度計の比例応答領域の中で調整する。 例えば、1mg/mlでの二本鎖DNAは、1cmの光路長セルを使用してA260が約20であるので、例えば、10,20,40および80倍の希釈を行う。 NanoDrop分光光度計（Thermo Scientific）は、より短い経路長を有し（0.05〜1mm）、より高濃度のポリヌクレオチドを希釈することなしに 記録することができる（約15mg / mlまで）。

2. 核酸サンプルのA260nmでのUV吸光度は適合する溶媒で分光光度計をゼロにしてから測定する。

3. A260 nm吸光度の測定値を経路長（cm単位）か吸収係数のいずれかで割ること：

   . 二本鎖DNA（約0.020（μg/ ml）^-1cm^-1）、

   . 一本鎖DNA（約0.027（μg/ ml）^-1cm ^-1）または

   . 一本鎖RNA（約0.025（μg/ ml) ^-1cm ^-1）

   そして、希釈倍率を乗じて核酸濃度の近似値を得る

オプションB：タンパク質濃度の評価。¶

タンパク質の場合、アミノ酸分析（AAA）がおそらくタンパク質濃度を決定する最も正確な方法であり、タンパク質濃度分析を較正するためのデータを提供するが、完了するまで数日から一週間かかることがあり、熟練した人員や特殊施設にアクセスする必要がある。したがって、我々はタンパク質の濃度を280nmでの吸光度を使用して分光学的に測定するか、あるいは屈折率を使用して測定することをお勧めする。屈折率測定は、若干の変更により、核酸の分析にも使用することができる。結合アッセイ色素（例えばブラッドフォード試薬）の使用は、色素アッセイが（別の技術と比較して）自信を持って標準化されている場合を除いて、タンパク質濃度を決定するのには一般にあまり正確ではない。較正用の既知量の粉末状タンパク質の濃度を推定することは、粉末タンパク質試料にしばしば付随する未知の量の塩および他分子の存在により、一般に困難である。

1. マッチした溶媒を用いて分光光度計をゼロにした後に、タンパク質の280nmでの吸光度を測定してタンパク質濃度を評価する。 吸光度の読みを光路長とタンパク質吸収係数で割る。吸光係数は、タンパク質のアミノ酸配列から計算される（例えば、 Protparam を使用する：http://web.expasy.org/protparam /）。

   重要

   <重要なステップ>

   分光光度法を用いて生体高分子濃度を評価する場合、支持溶媒中の時間依存性または化学変化を考慮する必要がある。 ジチオスレイトール（DTT）のようなチオール還元剤は、それらが酸化を受けるときにそのUV吸収特性を変化させうる、あるいは染料に基づく分析に直接干渉しうる。 DTTおよび代替のチオール還元剤、β-メルカプトエタノールの両方は、pH7.5より高いpHで比較的短い半減期を有し（温度に依存して約1-20時間）、そして、DTTは、Zn ²⁺ のような生物学的に関連するいくつかの金属イオンに対してキレート剤として作用し、その結果吸収特性を変化させ 濃度推定値を混乱させる。 TCEP-HCLは、はるかに安定した優れた代替物であり、A280 nmの読み取り値には無視できる影響しかないが、中性pHのリン酸緩衝液中で有効性が損なわれる。 非常に酸性であるので、TCEP-HCL添加後に溶媒のpHを意図した値に戻すように注意する必要がある。

   注釈

   TCEP-HCL

   Tris(2-carboxyethyl)phosphine Hydrochloride。ジスルフィド結合を切断する還元剤。特長としては、毒物非該当、還元力が強い、無臭、広範囲のpHで使用可能などである。

   

2. 代換えとして、タンパク質サンプルについて屈折率（RI）測定を実施する。 屈折率はタンパク質濃度を評価するには極めて有用なツールである。というのは、タンパク質の 屈折率増分（約0.185ml/g）はA280nm吸光係数とは異なり、アミノ酸配列組成の変化に対して比較的安定なであるからである。 RI増分は、核酸（DNA：約0.17ml/g、RNA：0.17-0.19ml/g）についても応用できる。 それゆえ、RIは、例えば、A280nmの吸光係数が小さいタンパク質またはタンパク質/ DNA複合体など、濃度を決定するためにより有用であろう。

オプションA： I(0) からの MW 、SAXS。¶

SAXSについては、サンプルをスケーリングして濃度依存 I(0)_MW 分析を行う。これは濃度がわかっている標準タンパク質の散乱データにサンプルの散乱データをスケーリングすることにより行われる。 この標準タンパク質は、試料と同様のコントラストを有するべきである（例えば、水溶液中のタンパク質試料についてはリゾチーム標準を使用する）。

1. MW 標準と対応する溶媒ブランクからSAXSデータを収集する。温度、露光時間、サンプル（キャピラリー）セルなど同じ実験セットアップを使用すること。 散乱データを一次元化して（例えば、2Dデータを半径方向に平均して1Dデータにする）、標準と溶媒の差分していない \(I(q)\) 対 q プロファイルを作成する。

   注釈

   点光源ではない装置、例えばKratkyカメラでは、関連するビーム形状補正をSAXSデータに適用する。

2. 標準タンパク質の散乱から溶媒の散乱を差し引いて、溶液中の標準高分子の \(I(q)\) 対 q 、1D差分プロファイルを得る。

3. 未知 MW およびそれに対応する一致した溶媒がサンプルについてデータ収集手順を繰り返す。その溶媒を用いて試料を希釈して濃度希釈シリーズ（例えば、 8,6,4および2 mg/ml）を作る。 データを処理して、溶液中のサンプルタンパク質の \(I(q)\) 対 q 、１D差分プロファイルを得る。 必要に応じてビーム形状補正を適用する。

4. Guinier近似（例えば、 AUTORG を使用）または計算された実空間2点間距離分布関数 \(p(r)\) 対 r の面積（例えば、 AUTOGNOM を使用） を使用して、標準高分子および試料高分子の \(I(0)\) を計算する。

5. 以下の式を使用して、標準に対するサンプルのMWを決定する

   \[MW_{sample}=\dfrac{I(0)_{sample}}{I(0)_{standard}}\times \dfrac{c_{standard}\Delta\rho^2_{standard}\nu^2_{standard}}{c_{sample}\Delta\rho^2_{sample}\nu^2_{sample}} \times MW_{standard}\]

   正確に記録された濃度は c （w/v 単位、mg/ml）であり \(\nu\) は部分偏比容（cm³ /g）である。

6. サンプル濃度を変えた時に、サンプルの MW が系統的に減少または増加することが観察されるかどうかを評価する。 濃度上昇でのサンプルの MW の増加は、濃度依存性の オリゴマー化または凝集の徴候である。 濃縮上昇が典型的な排除粒子間干渉によって引き起こされる場合、サンプルの見掛け分子量は有意に減少する。

7. \(I(0)\) から実験的に決められたサンプルの MW と（ Protparam を使用して）アミノ酸配列から計算される予想される MW を比較する。 結果を使用して、サンプルのオリゴマー化または凝集状態を評価する。

   <オプション>独立した光散乱実験（例えば、SLSまたはSEC-MALLS / RI）、またはタンパク質については、SAXSデータから計算された散乱体積に基づく濃度非依存MWを測定値とクロスチェックする。

オプションB：SAXSおよびSANSの \(I_{water}(0)\) からの MW 。¶

1. サンプルの散乱データ \(I(q)\) を単位cm ^-1 を有する絶対強度に変換し、SAXSの \(I(0)\) MW 分析を行う。 SAXSの場合、絶対強度測定は、 通常、水からの散乱を基準として使用して行われる。

   注釈

   ちなみに、絶対強度={散乱光強度}/{入射光強度} のことである。

2. キャピラリー（またはサンプルセル）内の純水からSAXSデータを測定し、差分をかけていない1D散乱プロファイルを取得する。

3. 純水の測定に使用されたものと同一で空のキャピラリー/サンプルセルから \(I(q)\) 対 q を測定する。空のキャピラリー/サンプルセルが完全に乾燥していること、 およびX線の露光時間と温度が純水の測定と同じであることを確認する。

4. 純水の散乱から空のキャピラリー/サンプルセル散乱の寄与を除き、純水のみの差分 \(I(q)\) 対 q のプロファイルを得る。

   注釈

   差分する前に透過率を補正する必要がある。ただし、BS位置で強度をモニターしているのなら透過率込みの量が出力されているのでそれでそのまま規格化できる。

5. 水の前方散乱強度の実験値、実験値 \(I_{water}(0)\) 、すなわち「装置値」を記録する。水の前方散乱を計算する簡単な方法は、中〜高角 q の領域、 すなわち水のSAXSプロファイルが「フラットな散乱領域」における \(I(q)\) の平均の大きさを決めることである （補足情報の表計算シート： MW_from_absolute_scale.xlsx を参照のこと）。

   注釈

   純水の広角領域の散乱断面積 \(\Sigma\) は等温圧縮率 \(\chi_T\) と密度 \(\rho\) に依存し、以下の式で表される。

   \[\dfrac{d\Sigma}{d\Omega}=I_{water}(0)_{standard}=\rho^2kT\chi_T\]

   

6. 次に、純水測定と同じ温度、キャピラリー/サンプルセルでサンプルと一致する溶媒ブランクからSAXSデータを収集する。 サンプル+セル から 溶媒+セル を差し引いて、サンプルの差分 \(I(q)\) 対 q プロファイルを得る。

7. サンプル高分子の散乱強度 \(I(q)\) に次の比を掛けることによって絶対的なスケール（cm^-1 ）に散乱を変換する：

   \[\dfrac{I_{water}(0)_{standard}}{I_{water}(0)_{experimental}}\]

8. ここで、 \(I_{water}(0)_{standard}\) は、特定の温度での水からの既知の前方X線散乱 \(I(0)\) である （ MW_from_absolute_scale.xlsx のシート2を参照）。298Kでは \(I_{water}(0)_{standard,298K}=0.01633 \,\rm{cm^{-1}}\) である。 サンプル中の高分子の \(I(0)\) を、絶対スケールのSAXSデータからGuinier近似または \(p(r)\) vs r など標準的な方法を使用して計算する。

9. もし \(I(0)\) をcm^-1 の絶対スケールに変換し、 c をgcm^-3 で求めると、高分子の分子量は次の式で評価することができる。

   \[MW_{sample}=\dfrac{I(0)_{sample}N_A}{c_{sample}(\Delta\rho\nu_{sample})^2}\]

   ここで \(N_A\) はアボガドロの数であり、 \(\Delta\rho\nu_{sample}\) は高分子のコントラスト（ \(\Delta\rho\) 、cm^-2 ）と 部分偏比容（ \(\nu_{sample}\) 、cm³ g^-1 ）の積である。補足情報スプレッドシート MW_from_absolute_scale を参照してください。 さらに詳しい説明はBox 2を参照してください。

10. サンプルの入射光束に対する散乱強度を正規化することにより、透過率と機器の形状補正して、SANSデータの絶対スケーリングを実行する。 異なるSANS装置は、 異なる手順で機器の絶対較正を行う。 幸いなことに、ほとんどの施設でSANSデータをcm^-1 で提供しているため、追加のデータスケーリングの必要はない。 式4でコヒーレントな中性子散乱コントラストで \(\Delta\rho\) を置換して、式と同じ関係を用いて \(I(0)\) から MW を決定する。 （Contrast によって計算される、ボックス2を参照）。