.. サンプルのI(0)決定とMW ======================================= サンプルの :math:`I(0)/C` 決定と *MW* ======================================= サンプルの絶対強度測定による分子量の決定は、 * 対象となる :file:`*.dat` とがどのように規格化されているか * 得られた :math:`I(0)/C` から以下の式に基づきどのソフトを使って *MW* を計算するか .. math:: MW_{sample}=\dfrac{I(0)_{sample}}{c_{sample}} \dfrac{N_A}{(\Delta\rho\nu_{sample})^2} ここで、 :math:`I(0)_{sample}` 、:math:`c_{sample}` はそれぞれ、絶対強度スケールの :math:`I(0)/C` 、濃度の単位が :math:`\rm{g\, cm^{-3}}` のサンプル濃度を 表す。 によって変わってくる。 ここでは ``BL45XU-SAXS`` 標準のソフトにより生成される :file:`*.dat` と 藤澤研固有の :program:`tk_Pila2dat.py` により生成される :file:`*.dat` の２通りのやり方を紹介する。 サンプルはBSAを例とし、 :program:`MULCh` から以下のパラメータを得られているとする。 .. list-table:: :header-rows: 2 * - :math:`\nu_{sample}` - :math:`\rho_{BSA}` - :math:`\rho_{buffer}` - :math:`\Delta\rho` - :math:`I(0)_{sample}/c_{sample}` * - :math:`\rm{cm^3\, g^{-1}}` - :math:`\rm{10^{10}\, cm^{-2}}` - :math:`\rm{10^{10}\, cm^{-2}}` - :math:`\rm{10^{10}\, cm^{-2}}` - :math:`\rm{a.u.\, mg^{-1}mL}` * - 0.733 - 12.363 - 9.530 - 2.833 - 80.32 ``BL45XU-SAXS`` 標準のソフトにより生成される :file:`*.dat` の場合 ------------------------------------------------------------------- ``BL45XU-SAXS`` ではサンプルのデータフォルダの下に :file:`analysis` というフォルダが自動的に作成され、その中に :file:`subtraction-i2-*.dat` という ファイルが収められる。このファイルは、 *BS* で生のデータを規格化し、buffer散乱との差分を 行った後、重量濃度 *c* (mg/ml)で割ったものである。 エクセルで直接計算する場合 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 最初に水で決めた *fac* を用いて .. math:: I(0)_{sample}/c_{sample}=fac\times I(0)_{sample}/c_{sample} で :math:`\rm{mg^{-1}cm^2}` の単位とし、さらに重量濃度の単位を :math:`\rm{mg\, cm^{-3}}` から :math:`\rm{g\, cm^{-3}}` に変更する。 エクセルの表で .. list-table:: :header-rows: 2 * - :math:`I(0)_{sample}/c_{sample}` 相対強度 - :math:`I(0)_{sample}/c_{sample}` 絶対強度 - :math:`I(0)_{sample}/c_{sample}` 絶対強度 * - :math:`\rm{a.u. mg^{-1}cm^3}` - :math:`\rm{mg^{-1}cm^2}` - :math:`\rm{g^{-1}cm^2}` * - 80.32 - 0.04278 - 42.78 絶対強度の :math:`I(0)_{sample}/c_{sample}` が求まれば、 .. list-table:: :header-rows: 2 * - :math:`\nu_{sample}` - :math:`\Delta\rho` - :math:`(\Delta\rho\nu_{sample})^2` * - :math:`\rm{cm^3g^{-1}}` - :math:`\rm{cm^{-2}}` - :math:`\rm{g^{-2}cm^2}` * - 0.733 - 2.8330E+10 - 4.3122E+20 から :math:`(\Delta\rho\nu_{sample})^2` を求め、上の式に直接代入すれば良い。 :program:`RAW` を使用する場合 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ :program:`RAW` では、 *fac* を設定すると自動的に絶対強度に変換するオプションも存在するが確認していない。 :math:`I(q)` は絶対強度に変換して :math:`I(0)_{sample}/c_{sample}` の形で 以下のように :program:`RAW` を使えば良いであろう。 :program:`tk_Pila2dat.py` により生成される :file:`*.dat` の場合 --------------------------------------------------------------- :program:`tk_Pila2dat.py` により生成される :file:`*_sc.dat` は、生のデータを :math:`BS\times Time` で割り、差分データは重量濃度 :math:`c \rm{(mg/ml)}` で割っている。 すでに絶対スケール :math:`\rm{(cm^2g^{-1})}` に変換されている :math:`I(0)_{sample}/c_{sample}` である。 エクセルで直接計算する場合 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 上記のように、 :math:`(\Delta\rho\nu_{sample})^2` を求め計算を行う。単位だけを気をつければよい。 :program:`RAW` を使用する場合 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ :program:`RAW` を使えば、ギニエ解析を行って :math:`I(0)` 、 Rgを決定すると、絶対強度から 分子量を決定してくれる。また、Porod体積などからの分子量も算出してくれる。 具体的な手順は、 1. メイン画面からフォルダを選択して、 :file:`*.dat` ファイルを ``load`` する。 .. image:: raw1.png :scale: 50 .. image:: raw2.png :scale: 40 2. 解析するデータ範囲を指定する。 ``Main Plot`` 画面を右クリックして、 ``Porod plot`` 表示にする。 .. image:: raw_1_1.png 重要なのは広角側をどれだけとるかということであるが、 ``Porod plot`` で一定となる領域を指定する。 ついでに小角側の立ち下がりも削除しておく。 .. image:: raw_1.png 3. :menuselection:`Control Panel --> Manipulation Tab` から ``load`` されたデータを右クリックして ギニエ解析を起動する。 .. image:: raw3.png :scale: 50 4. ギニエ領域を指定して、 :math:`I(0)` 、 :math:`Rg` を得る。 .. image:: raw4.png :scale: 70 5. :menuselection:`Control Panel --> Manipulation Tab` から ``load`` されたデータを右クリックして :program:`GNOM` を起動する。 .. image:: raw5.png :scale: 40 6. :math:`P(r)` 関数の計算領域、 ``n_min`` 、 ``n_max`` を指定して、 ``GNOM says`` が 良い応答を示すよう ``Dmax`` を調整する。 .. image:: raw6.png :scale: 70 7. :math:`I(0)` 、 :math:`P(r)` 関数などを計算した後に、 :menuselection:`Control Panel --> Manipulation Tab` から ``load`` されたデータを右クリックして分子量決定タブを起動する。 .. image:: raw7.png :scale: 40 8. すでに :math:`I(0)` 、 :math:`P(r)` 関数などを計算しているので、相関体積 :math:`Vc` 、Porod体積 :math:`Vp` から分子量がそれぞれ ``Vc MW`` 、 ``Vp MW`` として表示されている。絶対強度による分子量 ``Abs.MW`` を 表示させるには、 :menuselection:`Change Advanced Parameters` をクリックする。 .. image:: raw8.png :scale: 70 9. 対象となるタンパク質の小角散乱パラメータを設定する。必要な値は以下のとおりである。 * ``Electrons per dry mass of macromolecule`` :math:`\rm{(e^{-}g^{-1})}` ：1分子の乾燥重量あたりの電子数 これは対象のタンパク質のプロトマーのアミノ酸配列から電子数を計算する。 :program:`MULCh` は1分子あたりの散乱長 :math:`\Sigma b_X` を計算してくれるのでそこから算出する。 .. image:: raw9.png :scale: 70 一電子の散乱長は古典電子半径 :math:`r_0=e^2/m_ec^2=0.28179\times 10^{-12} \rm{cm}` で与えられるので、 一分子の質量を :math:`M_1` とすれば、 .. math:: \Sigma b_x \,\,\rm{(cm)}/r_0 \,\,\rm{(cm)} / M_1 \,\,\rm{(g)} * ``Electrons per volume of aqueous solvent`` :math:`\rm{(e^{-}cm^{-3})}` : 溶媒の体積あたりの電子数 これは溶媒の散乱長密度 :math:`\rho_x` を単位変換すればよい。 .. math:: \rho_x \,\,\rm{(cm^{-2})}/ r_0 \,\,\rm{(cm)} * ``PSV of macromolecule`` :math:`\rm{(cm^3g^{-1})}` : タンパク質の偏比容 これは、計算値を代入すれば良い 　 * ``scattering length of an electron`` :math:`\rm{(cm/e^{-})}` : 一電子の散乱長は古典電子半径 上に書いたように固定。 10. ``Intensity on the Absolute Scale`` をチェックして濃度を入力する。ここでは、 ``1.0`` を入力する。 分子量が表示されている。 .. image:: raw10.png :scale: 70 .. important:: :program:`tk_Pila2dat.py` では、桁落ちを回避するために :math:`10^3` かけた変換係数を入力するので 出力される分子量の値は ``kDa`` ではなく ``Da`` 表記となる。 .. note:: :program:`RAW` でのコントラストは質量あたりの散乱コントラスト :math:`\Delta\rho_M \,\,\rm{(cm\,g^{-1})}` である。 いわゆるコントラスト :math:`\Delta\rho` とは、 :math:`\Delta\rho_M=\Delta\rho\nu` の関係となる。 :math:`\Delta\rho_M` は以下の式で求まる。 .. math:: \Delta\rho_M=(1/M_1)\Sigma_j b_j-\rho_{M,solv}