Roll tube method　2011/08/17

絶対嫌気性微生物の代表的な分離培養法のひとつです。
R. E. Hungate & J. Macy（1973）を基に改変しています。

手順

1. 準備
1) 培地（2倍濃度）40 mL
脱気後、オートクレーブしたもの。W mediumではNaHCO3をオートクレーブ前に添加したもの（原著では滅菌ろ過したものをオートクレーブ後添加する）。オートクレーブ後、仕様前に45°Cで保温する。ロールチューブ8本分相当。
2) 4% Noble agar suspension 5 mL
Noble agar (Difco) を複数回超純水で洗浄したものを、約4%となるようにして、50 mLバイアル瓶に分注、脱気、オートクレーブ105°C、1分する。オートクレーブを繰り返し行わないように、オートクレーブ後直ぐに使用する。45°Cで保温する。
3) 培地
培養液を希釈する為に、必要量準備する。釣菌後の植菌用にコロニーの数だけ準備する。
4) 培養液
活きのいいものを使いましょう。Stationary phase手前か、少し過ぎたあたりのもの。
5) 氷冷水
底の浅いバット（発泡スチロールの蓋などでいい）に氷を敷き詰め、水を張ったもの。
6) パスツールピペットとシリコンチューブ
パスツールピペットに綿栓をして乾熱滅菌をする。シリコンチューブは1 m程の長さにする。
7) その他
注射針、シリンジ、エッペンチューブ、チップ、ピペットマンなどなど。

2. 培養液の希釈
培養液を培地を使って希釈する。エッペンチューブに適量培地をとり、ピペットマンで180 µLずつ分注する。
シリンジと注射針を使って、培養液をエッペンチューブにとり、ピペットマンで20 µLの培養液を培地が入ったエッペンチューブに添加する（10倍希釈）。
10倍希釈を使って同様に希釈していき、102を作り、以降103...と希釈する。

3. 寒天溶液に培地（2倍濃度）を添加
培地（2倍濃度）は基質や還元剤を添加したもの加温しておき、5 mLをシリンジと注射針を使ってとりだす。加温しておいた寒天溶液のバイアルに添加し、泡立てないようによく混ぜる。

4. 培養液の接種
培養液（希釈液）約0.1 mLをシリンジと注射針を使ってとりだし、寒天培地に接種する。泡立てないようによく混ぜる。

5. Roll tubing
培養液を添加した寒天培地のバイアルを氷水水に浸し、バイアルを素早く回転させる。寒天がバイアルの表面で固まり、ロールチューブの完成（3から5は、希釈系列ごとに行った方がいい）。

6. 培養
口を下向きにして培養する。

7. 釣菌、植菌
コロニーが現われたロールチューブから、適当な数のコロニーがある希釈系列を選び出す。バイアルの口にたまった凝集水をシリンジと注射針を使って捨てる。
シリンジと注射針を使って培地をエッペンチューブに少量（〜200 µL）とりだす。
パスツールピペットをシリコンチューブと連結する。チューブの末端を口で軽く咥えておく。パスツールピペットの先をバーナーの火で炙って曲げる。
パスツールピペットの先を培地が入ったエッペンチューブに漬けて、先端を湿らせておく。
バイアルのキャップを開けて、パスツールピペットの先端をコロニーに当てて、吸い出す。
ピペットの先端をエッペンチューブ内の培地に漬けて、培地を出し入れしてコロニーをエッペンチューブに移す。
シリンジと注射針を使ってコロニーをよく潰してから、培地にコロニー懸濁液を植菌する。

以上

動画は鉄還元菌用の培地です

慣れれば、植菌10分/本、釣菌・植菌5分/コロニーぐらいでしょうか

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